Cloxacillin benzathine-loaded polymeric nanocapsules: Physicochemical characterization, cell uptake, and intramammary antimicrobial effect.

The present work shows the development and evaluation of the veterinary antibiotic cloxacillin benzathine (CLOXB) loaded into poly-ε-caprolactone (PCL) nanocapsules (NC), as a potential new treatment strategy to manage bovine intramammary infections, such as mastitis. Staphylococcus aureus-induced mastitis is often a recurrent disease due to the persistence of bacteria within infected cells. CLOXB-PCL NC were prepared by interfacial deposition of preformed biodegradable polymer followed by solvent displacement method. The mean diameter of NC varied from 241 to 428 nm and from 326 to 375 nm, when determined by dynamic light scattering and by atomic force microscopy, respectively. The zeta potential of NC was negative and varied from -28 to -51 mV. In vitro release studies from the NC were performed in two media under sink conditions: PBS with 1% polyethylene glycol or milk. A reversed-phase HPLC method was developed to determine the NC entrapment efficiency and kinetics of CLOXB release from the NC. Free CLOXB dissolution occurred very fast in both media, while drug release from the NC was slower and incomplete (below 50%) after 9 h. CLOXB release kinetics from polymeric NC was fitted with the Korsmeyer-Peppas model indicating that CLOXB release is governed by diffusion following Fick's law. The fluorescence confocal microscopy images of macrophage-like J774A.1 cells reveal NC uptake and internalization in vitro. In addition, antimicrobial effect of the intramammary administration of CLOXB-PCL NC in cows with mastitis resulted in no clinical signs of toxicity and allowed complete pathogen elimination after treatment. The in vivo results obtained in this work suggest that CLOXB-PCL NC could be a promising formulation for the treatment of intramammary infections in cattle, considering their physicochemical properties, release profiles and effects on bovine mastitis control.

Contagem bacteriana da superfície de tetas de vacas submetidas a diferentes processos de higienizaçäo, incluindo a ordenha manual com participaçäo do bezerro para estimular a descida do leite / Bacterial counts on the surface of the teats of cows milked and different methods of udder preparation, including cows milked by hand and stimulated by suckling a calf

A pele da teta é uma das principais fontes de contaminaçäo microbiana do leite cru, além de ser uma fonte de infecçäo da glândula mamária. Este estudo comparou diferentes métodos de preparaçäo do úbere, incluindo a participaçäo do bezerro para estimular a descida do leite, em relaçäo à contaminaçäo microbiana da pele da teta. Um experimento com 36 vacas ordenhadas mecanicamente foi conduzido para comparar três procedimentos (A, B, C) de preparaçäo do úbere. Duas tetas de cada vaca foram amostradas para contagem total de bactérias (CTB) e de coliformes, antes e após lavagem com água e secagem com papel toalha descartável (A); procedimento A, mais imersäo das tetas em soluçäo de iodo (4.000ppm) e secagem com papel toalha descartável (B); higienizaçäo com toalha de papel embebida em soluçäo desinfetante contendo clorexidina (C). O segundo experimento incluiu 16 vacas ordenhadas manualmente, na presença do bezerro. Permitiu-se a cada bezerro mamar as quatro tetas por alguns segundos, de acordo com o manejo do rebanho. Amostras para bacteriologia de duas tetas de cada vaca foram coletadas, antes, após a mamada do bezerro, e após higienizaçäo semelhante ao procedimento C, citado acima. Os tratamentos foram analisados usando-se o teste näo-paramétrico de Kruskal-Wallis, considerando-se os dados de tCTB após o uso de um dos métodos de preparaçäo do úbere ou da mamada do bezerro. Usou-se a transformaçäo das contagens bacterianas para a escala logarítmica em base 10, com a fórmula tCTB=log10 (CTB+0,5). Para os grupos A,B e C (primeiro experimento), Os valores médios de diminuiçäo de tCTB foram 1,8, 2,2 e 2,4, respectivamente. No segundo experimento, as CTB's aumentaram significativamente (p<0,05) de 3,2 para 4,3 após a mamada do bezerro, mas houve uma reduçäo (P<0,01) de mais de dez vezes após a aplicaçäo do desinfetante (2,0). Os resultados indicaram que: (a) lavagem das tetas com água seguida de secagem com papel toalha reduz o número de microrganismos da superfície das tetas, mas a reduçäo é muito maior quando se emprega um desinfetante; (b) a mamada do bezerro antes da ordenha aumenta em mais de dez vezes o número de bactérias na superfície das tetas; (c) o número de bactérias na pele das tetas pode ser reduzido em mais de 90 por cento após a mamada do bezerro, se as tetas forem cuidadosamente desinfetadas. Nas condiçöes dos experimentos realizados, a presença de coliformes foi insignificante.

Sensibilidade e especificidade do "California Mastitis Test" como recurso diagnóstico da mastite subclínica em relação à contagem de células somáticas / Sensitivity and specificity of the California Mastitis Test as a diagnostic tool for subclinical mastitis in quarter somatic cell count estimation

O "California Mastitis Test" (CMT) estima o conteúdo de células somáticas no leite e é interpretado subjetivamente, estabelecendo-se escores que, na maioria dos casos, variam de 1 a 5. O escore 1 indica uma reação completamente negativa e os de 2-5 indicam graus crescentes de resposta inflamatória do úbere, sendo normalmente considerados como indicativos de mastite subclínica. Dependendo da interpretação dos escores, o CMT pode produzir resultados falso-positivos ou falso-negativos. Esse trabalho teve o objetivo de avaliar a sensibilidade e a especificidade do CMT em relação à contagem de células somáticas (CCS). Foram utilizadas 3.012 amostras de leite provenientes de 760 vacas Holandesas ou mestiças Holandês-Zebu, pertencentes a 15 rebanhos. Todas as amostras foram submetidas ao CMT e processadas para CCS em equipamento Fossomatic 90. Os valores médios de CCS (x 1.000 células/ml) obtidos para os escores de CMT foram 1 (79,9), 2 (333,5), 3 (670,3), 4 (1.354,0) e 5 (4.455,6). Três opções de interpretação (doente/não-doente) para o CMT foram testadas, em relação aos valores de CCS, iniciando com 100.000 células/ml: (a) 1 versus 2, 3, 4, e 5; (b) 1 e 2 versus 3, 4 e 5; (c) 1, 2, 3 versus 4 e 5. As sensibilidades do CMT em identificar corretamente quartos mamários acima de 200.000 células/ml foram 79%, 61% e 34%, para as opções a, b e c, respectivamente. Para identificar corretamente contagens acima de 500.000 células/ml, as sensibilidades do CMT, para as opções a, b e c, foram, respectivamente: 93%, 82% e 54%. A sensibilidade do CMT em identificar quartos mamários com mastite subclínica foi adequada (acima de 80%) quando a interpretação do teste foi mais rigorosa (opções a e b). A interpretação da reação 3 como negativa (opção c) só alcançou sensibilidade de 80% para contagens entre 1.200.000 e 1.400.000 células/ml. As especificidades do CMT, para CCS de 200.000 e 500.000 foram, respectivamente, 90% e 80% (opção a), 97% e 90% (opção b) e 99% e 97% (opção c)

Detecção de soroalbuminas e imunoglobulinas no leite bovino como indicadores de mastite subclínica / Evaluation of serum albumin and immunoglobulins in bovine milk as an indicator of subclinical mastitis

Com o objetivo de verificar a utilidade da detecção de soroalbumina (BSA) e imunoglobulinas (Ig) no leite como diagnóstico da mastite subclínica, avaliou-se a relação entre a concentração dessas proteínas, o exame microbiológico e o teste "California Mastitis Test" (CMT). Amostras de leite de 172 quartos mamários previamente examinadas pelo CMT foram colhidas e levadas imediatamente ao laboratório para exames bacteriológicos. Uma alíquota de cada amostra foi congelada a -20°C e posteriomente testada para a presença de BSA e Ig, por meio da técnica de imunodifusão radial simples. Das amostras testadas, 111 apresentaram níveis fisiológicos de BSA (< 0,2mg/ml) e de Ig (< 0,5 mg/ml), 22 apresentaram níveis elevados de ambas proteínas e 39 apresentaram níveis elevados de Ig, mas níveis fisiológicos de BSA. Concentrações de BSA e Ig acima dos limites fisiológicos foram observadas mais frequentemente em amostras onde o CMT apresentou reação de maior severidade (+++) e naquelas onde foram isoladas Streptococcus spp. e Staphylococcus aureus. Entre as 88 amostras positivas no exame bacteriológico, níveis de BSA e Ig acima do limite fisiológico foram observados em 10 e 35, respectivamente. Em amostras onde não se isolou bactérias (84 das 172 examinadas), níveis fisiológicos de BSA e Ig foram observados em 72 e 58 delas, respectivamente. A detecção de BSA e Ig nas amostras de leite forneceu informações adicionais sobre o grau de lesão tecidual, mas não pode ser considerada como um indicador sensível para detecção precoce da reação inflamatória.

This work aimed to evaluate the feasibility of milk serum albumin (BSA) and immunoglobulin (Ig) detection for the diagnosis of subclinical mastitis. Bacteriological examinations and concentrations of BSA and Ig were determined in 172 milk samples. The samples were also examined by the California Mastitis Test (CMT). Immediately after collection, the samples were taken to the laboratory and bacteriologically examined. An aliquot of each sample was kept at -20°C and later, concentrations of BSA and Ig were determined by radial immunodiffusion. A total of 111 milk samples had physiological levels of BSA (< 0.2 mg/ml) and Ig (< 0.5mg/ml). Twenty-two samples had higher levels of both proteins and 39 samples had higher levels of Ig and physiological levels of BSA. Concentrations of BSA and Ig above the physiological levels were more frequently observed in quarters samples with severo (+++) CMT reaction and udder infection caused by Streptococcus spp and Staphylococcus aureus. In bacteriologically positive quarters (88 out of 172), increased levels of BSA and Ig were found in 10 and 35 samples, respectively. In the bacteriologically negativo quartors (84 out of 172), physiological levels of BSA and Ig were found in 72 and 58 samples, respectively. Although BSA and Ig measurements in milk samples gave further information about udder tissue damage, they can not be used as a sensitive parameter to detect early inflammatory reaction.